La stagione 2009-2010 è stata la 64^a stagione in Serie A per il Napoli e la 68^a complessiva in massima serie.
Nella sessione estiva del calciomercato vengono acquistati Fabio Quagliarella dall'Udinese, Luca Cigarini dall'Atalanta, Hugo Campagnaro dalla Sampdoria, Juan Camilo Zúñiga dal Siena, Morgan De Sanctis dal Siviglia ed Erwin Hoffer dal Rapid Vienna. Per quanto riguarda i movimenti in uscita, Andrea Russotto - non riscattato - rientra al Bellinzona, Luca Bucci si svincola a fine contratto, mentre Daniele Mannini viene ceduto in comproprietà alla Sampdoria nell'ambito dell'operazione Campagnaro. Cristian Bucchi, rientrato dal prestito all'Ascoli, passa al Cesena con la medesima formula. Sempre con la formula del prestito, vengono ceduti Samuele Dalla Bona ai greci dell'Iraklis, Nicolás Navarro al River Plate, Marcelo Zalayeta al Bologna e Luigi Vitale al Livorno. Vengono, inoltre, risolte le comproprietà di Maurizio Domizzi e György Garics, che passano interamente a Udinese e Atalanta rispettivamente, oltre a quelle di Biagio Del Giudice e Tommaso Romito, che passano all'Aversa Normanna ed al Pescara, mentre viene rinnovata con il Siena quella di Emanuele Calaiò. Nell'ultimo giorno di calciomercato, a campionato già iniziato, vengono ceduti Manuele Blasi in prestito al Palermo e Francesco Montervino a titolo definitivo alla Salernitana.
La sede del ritiro precampionato è la città austriaca di Lindabrunn, dove la squadra resta dal 10 al 30 luglio. Nelle amichevoli contro le squadre locali, il 20 luglio il Napoli si impone per 2-0 sul St. Pölten e, il giorno successivo, per 4-1 sul Wiener Neustadt, squadra della Bundesliga austriaca. Il 30 luglio, nella terza ed ultima amichevole in terra austriaca, supera 5-1 il Sollenau. Nelle amichevoli successive, il 5 agosto il Napoli impatta per 0-0 contro l'Espanyol nella prima uscita stagionale al San Paolo, l'8 agosto si impone per 1-0 sul West Ham all'Upton Park di Londra nel trofeo dedicato a Bobby Moore, mentre l'11 agosto pareggia 1-1 con il Racing Santander.
La stagione ufficiale inizia il 16 agosto con il terzo turno di Coppa Italia, che vede il Napoli di scena al San Paolo contro la Salernitana; gli azzurri si impongono per 3-0, con le reti di Maggio, Lavezzi e del neo acquisto Hoffer. Nel corso del campionato viene rivoluzionata la struttura societaria: il 28 settembre 2009 si interrompe consensualmente il quinquennale rapporto con il DG Pierpaolo Marino, nonostante il contratto rinnovato solo pochi mesi prima. Stessa sorte tocca a Roberto Donadoni, sollevato dall'incarico il 6 ottobre 2009 - dopo aver raccolto sette punti in sette partite - e sostituito con Walter Mazzarri. Contemporaneamente, dalla Reggina arriva il Direttore Sportivo Riccardo Bigon, figlio di Alberto, allenatore del secondo scudetto azzurro. Il nuovo tecnico esordisce sulla panchina azzurra il 18 ottobre 2009 nella partita al San Paolo contro il Bologna, vinta per 2-1 con le reti di Quagliarella e Maggio dopo che i partenopei si erano inizialmente ritrovati in svantaggio. Nel turno successivo gli azzurri vincono in casa della Fiorentina grazie ad un altro gol dell'ex Maggio, interrompendo un digiuno di vittorie esterne che durava da un anno esatto. Dopo un 2-2 in rimonta contro il Milan al San Paolo, il Napoli espugna l'Olimpico di Torino vincendo 3-2 contro la Juventus grazie al primo gol "italiano" di Jesús Dátolo e ad una doppietta di Marek Hamšík, anche qui in rimonta dopo essere passato in svantaggio di due gol e ventuno anni dopo l'ultima vittoria azzurra in casa bianconera. Seguono tre pareggi consecutivi contro Catania (0-0), Lazio (0-0) e Parma (1-1), quindi il 6 dicembre 2009 gli azzurri tornano alla vittoria nel match contro il Bari al San Paolo, superando 3-2 i pugliesi con rete di Maggio e doppietta di Quagliarellae portandosi a otto risultati utili consecutivi, eguagliando - limitatamente alla massima serie - la serie utile ottenuta nel torneo 1993-1994 con Marcello Lippi in panchina. Dopo un pareggio esterno contro il Cagliari (3-3), il Napoli chiude il 2009 superando il Chievo Verona al San Paolo (2-0) e allungando la serie utile a dieci partite. Nel 2010 gli azzurri ripartono con le vittorie ottenute a Bergamo contro l'Atalanta (0-2) ed in casa contro la Sampdoria (1-0), chiudendo il girone d'andata al 3° posto con 33 punti.
Nella sessione invernale del calciomercato viene prelevato l'esterno Andrea Dossena dal Liverpool a titolo definitivo, mentre viene ceduto in prestito al Torino l'attaccante brasiliano Piá. Con la medesima formula vengono ceduti Jesús Dátolo ai greci dell'Olympiakos, Matteo Contini agli spagnoli del Real Saragozza e Nicolás Amodio al Piacenza. Nel frattempo, nel mese di gennaio, si chiude il cammino dei partenopei in Coppa Italia, con la sconfitta subita ad opera della Juventus negli Ottavi di Finale (3-0 per i bianconeri nella gara secca a Torino e prima sconfitta per Mazzarri).
Dopo due pareggi interni consecutivi contro Palermo e Genoa (entrambi per 0-0), intervallati dalla vittoria di Livorno (0-2), il Napoli di Mazzarri ottiene la prima sconfitta in campionato nella trasferta di Udine del 7 febbraio 2010 (3-1 per i padroni di casa); la serie di risultati utili si ferma così a quota quindici (8 vittorie e 7 pareggi), seconda soltanto ai sedici risultati utili consecutivi ottenuti nel 1989-1990, anno del secondo scudetto. Dopo un periodo di flessione - quattro punti nelle successive sei partite - il Napoli torna alla vittoria il 25 marzo superando la Juventus al San Paolo (3-1). Il 18 aprile 2010 il Napoli supera in trasferta il Bari (1-2) e raggiunge quota 52 punti, nuovo record per il club azzurro in massima serie con i 3 punti per vittoria. Il record precedente risaliva alla stagione 1994-1995 ed era di 51 punti, quando ad allenare il Napoli c'era Vujadin Boškov e il torneo era composto da 18 squadre. Con la vittoria a Verona contro il Chievo (1-2) del 2 maggio 2010, sesto successo esterno del campionato (eguagliato il record della stagione 1951-1952 nei tornei di massima serie a 20 squadre), il Napoli ottiene l'aritmetica qualificazione in UEFA Europa League 2010-2011 con due giornate di anticipo, quindi con la successiva vittoria al San Paolo ai danni dell'Atalanta (2-0) i partenopei si assestano definitivamente al 6° posto in classifica, miglior risultato dalla stagione 1993-1994.